生产生物柴油最常用的是反酯化法。新开发的反酯化方法可克服碱催化反酯化的缺点，如甘油回收和催化剂脱除困难、反应不完全，以及当油中含有游离脂肪酸和/或水时会生成皂化产物。该方法采用无催化剂的超临界甲醇在350℃、30.6MPa下，反应时间为240秒，醇/植物油克分子比为42/1。
另一种开发中的工艺可降低常规工艺的化学和能耗费用。采用碱催化反酯化(特定的反甲基化)，缓慢的反应动力学形成两相反应混合物，使反应受到传质限制。而新开发的方法使用共溶剂，可形成富油单相系统，因此反应可在室温下快速进行，10分钟内反应可完成95%，而现用工艺要几个小时。该工艺已在德国莱尔(Leer)8万吨/年验证装置上应用，第二套10万吨/年装置也在德国汉堡投运。
生物柴油的工业化生产作为石油基柴油的替代路线往往还不甚经济，因为其生产费用约为石油基柴油的3倍。现在的生物柴油生产商仍采用高压、高温方法，速度慢且能耗高；采用化学方法也不能低成本地生产达到ASTM标准的生物柴油。加拿大BIOX公司正在将DavidBoocock公司开发的技术(美国专利6642399和6712867)推向工业化。该工艺不仅可提高转化速度和效率，而且可采用酸催化步骤使含游离脂肪酸高达30%的任意原料(包括大豆油、废弃的动物脂肪和回收的植物油)转化为生物柴油。该工艺可降低生产费用高达50%。如果商业化成功，有望使生物柴油生产费用与石油基柴油相竞争。BIOX公司自2001年4月起在加拿大奥克韦尔(Oakville)100万升/年中型装置上验证了称为BIOX的工艺，现正在HamiltonHarbour生产地投资2400万美元建设6000万升/年生物柴油装置放大BIOX工艺。该装置定于2005年6月投运，这将是BIOX公司第一套工业化装置。在BIOX工艺中，脂肪酸首先在酸催化反应中转化成甲酯，反应在接近甲醇(溶剂)60℃的沸腾温度下，在柱塞流反应器(PFR)中进行。40分钟反应后，在相似条件下，在第二台PFR中采用专用的共溶剂进行碱催化反应，三甘油酯在几秒内就转化成生物柴油和丙三醇副产物，99.5%以上未使用的甲醇和共溶剂循环利用，回收冷凝潜热用以加热进料。传统的碱催化方法从三甘油酯和甲醇生产脂肪酸甲酯存在几个问题，包括在室温下反应速率太慢。植物油的催化反酯化(特别是反甲基化)生产生物柴油甲酯过程很慢。这是因为初期反应混合物由两相组成，反应受到传质限制。在新工艺中，惰性的共溶剂使之形成富油、单相系统，整个反应在该系统中进行，因此可提高传质和反应速率。碱催化步骤在接近室温和常压下于几分钟内完成，它与酸催化步骤结合在一起，使BIOX工艺可连续进行。BIOX工艺还克服了生物柴油现有生产路线的另外一些缺点，包括必须使系统达到所需纯度，以免反应中断，以及它们不能处理含脂肪酸大于1%的物料。使用常规技术生产生物柴油的成本因原料而变化，原料占生物柴油生产费用约75%～85%，因此采用低费用的原料达到高的转化率至关重要。
Diester工业公司在法国塞特建设生产脂肪酸甲酯(FAME)的新装置，16万吨/年生物柴油装置于2005年底投产。这是采用Axens公司Esterfip-H工艺的第一套工业化装置。Esterfip-H工艺由法国石油研究院(IFP)研发，由Axens公司推向商业化。第一套工业化Esterfip工艺装置于1992年建于法国Diester工业公司维尼特地区，基于均相催化剂。而新装置则采用多相催化剂——两种非贵金属的尖晶石混合氧化物，属首次应用。它可避免采用均相催化剂，如氢氧化钠或甲醇钠的工艺所需的几个中和、洗涤步骤，以及不会产生废物流。此外，来自Esterfip-H工艺的丙三醇副产物的纯度大于98%，而采用均相催化剂路线时，其纯度约为80%。这种副产物的利用可提高整个生产的经济性。在连续法Esterfip-H工艺中，反酯化反应采用过量甲醇在比均相催化剂工艺温度较高的条件下进行，过量甲醇用蒸发方法除去，并循环至工艺过程，与新鲜甲醇相混合。该化学转化采用两个串联的固定床反应段来达到，分离丙三醇以改变平衡。每一反应器后的过量甲醇通过部分闪蒸除去，酯类和丙三醇再在沉降器中分离。生物柴油在甲醇最后回收后通过减压蒸发予以回收，然后提纯去除微量丙三醇。甲酯纯度超过99%，产率接近100%。
再一先进的工艺是在连续流动反应器中采用油与甲醇强化混合。2002年采用这一技术的10万吨/年生物柴油装置建于德国玛尔(Marl)，从该过程可回收1.2万吨/年高级丙三醇。该技术也在美国加州里弗代尔(Riverdale)南方动力公司的10万吨/年装置上应用。
另一创新工艺是采用连续反酯化反应器(CTER)，这一新技术可降低投资费用。Amadeus公司在澳大利亚西部建设的3.5万吨/年生物柴油装置采用CTER技术。
生物柴油是以含油植物、动物油脂以及废食用油为原料制成的可再生清洁能源。目前已实现产业化的生物柴油生产工艺主要是化学催化转酯法。但化学法制备生物柴油存在一些不可避免的缺点，如反应过程中使用过量的甲醇，后续处理过程较繁琐，油脂原料中的水和游离脂肪酸会严重影响生物柴油得率及品质，废碱(酸)液排放容易对环境造成二次污染等。而利用生物酶法合成生物柴油由于具有反应条件温和、醇用量小、无污染物排放等优点，日益受到人们的重视。用发酵法(酶)制造生物柴油，混在反应物中的游离脂肪酸和水对酶催化剂无影响，反应液静置后，脂肪酸甲酯即可分离。但利用生物酶法制备生物柴油目前存在着一些亟待解决的问题，如反应物甲醇容易导致酶失活、副产物甘油影响酶反应活性及稳定性、酶的使用寿命过短等。这些问题成为生物酶法工业化生产生物柴油的主要瓶颈。
现正在研究和改进生物酶法合成生物柴油技术。日本大阪市立工业研究所成功开发使用固定化脂酶连续生产生物柴油，分段添加甲醇进行反应，反应温度为30℃，植物油转化率达95%，脂酶连续使用100天仍不失活。反应后静置分离，得到的产品可直接用作生物柴油。
日本关西化学工程公司推出一种简易的低费用工艺，采用全细胞生物催化剂用于废植物油的反酯化。新技术将RhizopasOryzae细胞固定在由聚氨酯泡沫制作的生物质支撑多孔颗粒(BSP)上，以培养脂肪酶。添加戊二醛的0.1%溶液用于稳定RhizopasOryzae细胞，并改进脂肪酶活性。将废植物油加入带有BSP固定的细胞的含水培养液中，分步加入甲醇，反应在约30℃下进行，甲酯产率可达到90%。在6个批量循环之后，脂肪酶活性仍可保持。新工艺不会产生像碱催化路线那样的大量废水，也无须复杂的提纯过程，无游离酸或催化剂残渣存在，就可生成脂肪酸甲酯或副产物甘油。关西化学工程公司正在进一步开发这一技术，以便不久将其推向商业化应用。
一种操作简单、在常温常压下可将动植物油脂有效转化生成生物柴油的全新工艺生物酶法制生物柴油在清华大学中试成功。由该校再生资源与生物能源实验室开发的生物酶法生物柴油新工艺，为生物柴油的工业化生产提供了理想的途径，采用新工艺在中试装置上生物柴油产率达90%以上。用中试装置生产的生物柴油样品经中国石化集团石油化工科学研究院检测，产品技术指标符合美国及德国的生物柴油标准，并满足我国0号优等柴油标准。中试产品经发动机台架对比试验表明，与市售石化柴油相比，采用含20%生物柴油的混配柴油作燃料，发动机排放尾气中一氧化碳、碳氢化合物、烟度等主要有毒成分的浓度显著下降，发动机动力特性等基本不变。生物酶法因反应条件温和、醇用量小、无污染物排放等优点日益受到重视，但存在甲醇及副产物甘油影响酶的反应活性及稳定性、酶的使用寿命不长、成本高等问题，成为生物酶法工业化生产生物柴油的瓶颈。对此，清华大学化工系再生资源与生物能源试验室提出了一条全新的生产工艺路线，可以有效消除甲醇及副产物甘油对酶反应活性及稳定性的负面影响，酶的使用寿命也随之大大延长。该工艺在湖南海纳百川生物工程有限公司200千克/日的生物柴油中试装置上得到成功应用，以菜籽油为原料生产出生物柴油。中试装置的反应器连续运转3个多月，生物酶活性未表现出明显下降趋势。另外，利用目前已有的技术还可以将生物柴油生产过程中的副产物甘油进一步转化为高附加值产品1，3-丙二醇。两项技术的有机结合，可以显著提高生物柴油生产过程的经济效益。
清华大学完成的生物酶法转化可再生油脂原料制备生物柴油新工艺通过教育部鉴定。利用这项创新工艺制备的生物柴油样品经检测，关键技术指标符合美国及德国生物柴油标准，并符合我国0号优等柴油标准。这种环境友好的生物酶法生物柴油技术将有望实现产业化。
针对生物酶法工艺瓶颈问题，清华大学课题组提出生产工艺，从根本上解除传统工艺中反应物甲醇及副产物甘油对酶反应活性及稳定性的负面影响，酶的使用寿命显著延长。利用该新工艺生产生物柴油，操作简单，常温常压下可将动植物油脂有效转化成生物柴油，产率达90%以上。另外，在该新工艺中，脂肪酶不需任何处理就可直接用于下一批次反应，并且表现出相当好的操作稳定性。该新工艺已在反应器上连续运转了10个多月，近200个反应批次，酶反应活性未表现出任何下降的趋势。新工艺显著延长了酶的使用寿命，大大降低了酶的使用成本，有望采用环境友好的生物酶法实现生物柴油的产业化生产。
通过加氢裂化方法也可生产生物柴油，现已开发了几种新工艺。加氢裂化方法不联产丙三醇。可将植物油转化为高十六烷值(～100)、低硫柴油，可加工宽范围原料包括高含游离酸的物料。加氢裂化过程中发生几种反应，包括加氢裂化、加氢处理和加氢。产率为75%～80%，十六烷值高(～100)，硫含量小于10ppm。28天后可生物降解95%，而石油基柴油在同样时间内降解40%。与其他生物柴油比，主要优点是可降低NOx排放。该工艺采用常规的炼厂加氢处理催化剂和氢气，可供炼油厂选用，因有氢气可用，可方便地与炼油厂组合在一起。
芬兰纳斯特(Neste)石油公司投资1亿欧元在芬兰帕尔伏炼油厂建设加氢法生物柴油装置，这套能力为17万吨/年的装置于2007年夏季投产。这将是采用纳斯特石油公司新的NExBTL(新一代生物质制油)工艺的第一套装置。NExBTL法从可再生原材料生产柴油燃料，可灵活地使用各种植物油和动物脂肪。此工艺将脂肪酸加氢转化为烷烃和异构烷烃。2005年7月，纳斯特石油公司与道达尔公司签约评估在道达尔公司一炼油厂共同建设大规模生物柴油生产装置的可行性，NExBTL工艺将应用于该装置，于2008年投产。